飲料、茶葉及相關(guān)制品中二氟尼柳等18種化合物的測定
1 范圍
本方法規(guī)定了飲料、茶葉及相關(guān)制品中二氟尼柳等18種抗風(fēng)濕類化合物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。
本方法適用于飲料、茶葉及相關(guān)制品中二氟尼柳等18種抗風(fēng)濕類化合物的測定，其他基質(zhì)可參照本方法定性檢測。
2 原理
試樣經(jīng)甲醇水溶液提取，稀釋后采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，外標(biāo)法定量。
3 試劑和材料
除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。
3.1 試劑
3.1.1 乙腈（CH3CN）：色譜純。
3.1.2 甲醇（CH3OH）：色譜純。
3.1.3 甲酸（HCOOH）：色譜純。
3.1.4 乙酸銨（CH3COONH4）：優(yōu)級純或相當(dāng)者。
3.2 溶液配制
3.2.1 含0.05 %甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液：稱取0.154 g乙酸銨（3.1.4），加入適量水溶解, 再加入0.5 mL甲酸（3.1.3），用水定容至1000mL。
3.2.2 甲醇水溶液（4+1）：準(zhǔn)確量取400 mL甲醇（3.1.2）和100 mL水，混勻后備用。
3.3 標(biāo)準(zhǔn)品
二氟尼柳、美洛昔康、舒林酸、吡羅昔康、醋氯芬酸、貝諾酯、依托考昔、萘普生、芬布芬、奧沙普秦、尼美舒利、氟比洛芬、雙氯芬酸鈉、依托度酸、吲哚美辛、萘丁美酮、非普拉宗、塞來昔布標(biāo)準(zhǔn)品的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量詳見附錄A中的表A.1，各標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥95%。
3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液(500 μg/mL)：準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品（3.3）50.0 mg（精確至0.0001 g），分別置于100 mL容量瓶中，美洛昔康加5mL水溶解，再用甲醇（3.1.2）稀釋至刻度，其余標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度各為500 μg /mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20℃保存，有效期3個月。
3.4.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液A（1 μg/mL）：分別準(zhǔn)確吸取0.2 mL美洛昔康、舒林酸、吡羅昔康、貝諾酯、依托考昔、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、依托度酸、非普拉宗各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（3.4.1），置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.2）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液A，-20℃保存，有效期1個月。
3.4.3 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液B（5 μg/mL）：分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL二氟尼柳、醋氯芬酸、萘普生、芬布芬、尼美舒利、氟比洛芬、吲哚美辛、萘丁美酮、塞來昔布各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（3.4.1），置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.2）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液B，-20 ℃保存，有效期1個月。
3.4.4 混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液A和B適量，置于同一容量瓶中，用甲醇（3.1.2）稀釋配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液S1~S5?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)中間液A（3.4.2）中各化合物濃度為2ng/mL、4ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL；混合標(biāo)準(zhǔn)中間液B（3.4.3）中各化合物濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200ng/mL；臨用新制或依儀器響應(yīng)情況配制適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
3.5 微孔濾膜：0.22 μm，有機(jī)相。
4 儀器和設(shè)備
4.1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI源）。
4.2 粉碎機(jī)。
4.3 電子天平：感量分別為0.0001 g和0.01 g。
4.4 超聲波水浴。
5 試樣制備
5.1 飲料
充分混勻，直接取用。
5.2 茶葉及相關(guān)制品
取適量有代表性的試樣，粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，裝入潔凈容器中，密封并標(biāo)記。
6 分析步驟
6.1 樣品提取
6.1.1 飲料
準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣置于50 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2），搖勻（固體飲料需充分溶解），再用甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2）定容至刻度，混勻，經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾，取濾液，根據(jù)實際濃度適當(dāng)?shù)南♂屩凉ぷ髑€線性范圍內(nèi)，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。
6.1.2 茶葉及相關(guān)制品
準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣置于25 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2），搖勻，超聲30 min，冷卻至室溫后，用甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2）定容至刻度，混勻靜置10 min，準(zhǔn)確吸取2 mL上清液至10 mL容量瓶中，用甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2）定容至刻度，混勻，經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾，取濾液，根據(jù)實際濃度適當(dāng)?shù)南♂屩凉ぷ髑€線性范圍內(nèi)，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。
6.2 測定
6.2.1 儀器參考條件
6.2.1.1 液相色譜條件
a) 色譜柱：C18柱，100 mm× 2.1 mm，粒徑 2.2 μm，或性能相當(dāng)者。
b) 流動相：A為乙腈（3.1.1），B為含0.05 %甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液（3.2.1），梯度洗脫程序見表1。
c) 流速：0.3 mL/min。
d) 柱溫：35 ℃。
e) 進(jìn)樣量：2 μL。
表1 梯度洗脫程序
|
時間 (min) |
流動相A（%） |
流動相B（%） |
|
0 |
5 |
95 |
|
1 |
5 |
95 |
|
11 |
95 |
5 |
|
13 |
95 |
5 |
|
14 |
5 |
95 |
|
16 |
5 |
95 |
6.2.1.2 質(zhì)譜條件
a) 離子源：電噴霧離子源（ESI源）。
b) 檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。
c) 掃描方式：正離子模式和負(fù)離子模式。
d) 氣簾氣（CUR）、霧化氣（GS1）、輔助氣（GS2）、碰撞氣（CAD）均為高純氮氣或其他合適氣體，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)相應(yīng)參數(shù)使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求，電噴霧電壓（IS）、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數(shù)使用前應(yīng)優(yōu)化至最佳靈敏度，監(jiān)測離子對和定量離子對等信息詳見附錄B。
6.2.2 定性測定
按照上述條件測定試樣和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，如果試樣中的質(zhì)量色譜峰保留時間與混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中的某種組分一致（變化范圍在±2.5%之內(nèi)）；試樣中定性離子對的相對豐度與濃度相當(dāng)?shù)幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液的相對豐度一致，相對豐度（k）偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判定為試樣中存在該組分。
表2 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差
|
相對離子豐度（%） |
k>50% |
50%≥k>20% |
20%≥k>10% |
k≤10% |
|
允許的相對偏差（%） |
±20 |
±25 |
±30 |
±50 |
6.2.3 定量測定
將混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液（3.4.4）按儀器參考條件（6.2.1）進(jìn)行測定。以混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。若試樣檢出與混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液一致的化合物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線按外標(biāo)法以峰面積計算得到其含量。
二氟尼柳等18種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖見附錄 C。
7 結(jié)果計算
結(jié)果按式（1）計算：
…………………………………………（1）
式中：
X — 試樣中各待測物的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；
c — 從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中讀出的供試品溶液中各待測組分的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；
V — 試樣溶液最終定容體積，單位為毫升（mL）；
m — 稱樣量，單位為克（g）；
K — 試樣制備過程中的稀釋倍數(shù)。
計算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
8 檢測方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
8.1 靈敏度
當(dāng)飲料稱樣量為1 g，定容體積為50 mL，本方法中各化合物的定量限如下：
美洛昔康、舒林酸、吡羅昔康、貝諾酯、依托考昔、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、依托度酸、非普拉宗定量限為0.2 mg/kg；二氟尼柳、醋氯芬酸、萘普生、芬布芬、尼美舒利、氟比洛芬、吲哚美辛、萘丁美酮、塞來昔布定量限為1.0 mg/kg。
當(dāng)茶葉及相關(guān)制品稱樣量為1 g，定容體積為125 mL，本方法中各化合物的定量限如下：
美洛昔康、舒林酸、吡羅昔康、貝諾酯、依托考昔、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、依托度酸、非普拉宗定量限為0.5 mg/kg；二氟尼柳、醋氯芬酸、萘普生、芬布芬、尼美舒利、氟比洛芬、吲哚美辛、萘丁美酮、塞來昔布定量限為2.5 mg/kg。
8.2 準(zhǔn)確度
本方法在0.2~25 mg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為71%~116%。
8.3 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15 %。
附錄A
二氟尼柳等18種化合物相關(guān)信息
表A.1 18種化合物的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量
|
序號 |
中文名稱 |
英文名稱 |
CAS登錄號 |
分子式 |
相對分子質(zhì)量 |
|
1 |
二氟尼柳 |
Diflunisal |
22494-42-4 |
C13H8F2O3 |
250.2 |
|
2 |
美洛昔康 |
Meloxicam |
71125-38-7 |
C14H13N3O4S2 |
351.4 |
|
3 |
舒林酸 |
Sulindac |
38194-50-2 |
C20H17FO3S |
356.41 |
|
4 |
吡羅昔康 |
Piroxicam |
36322-90-4 |
C15H13N3O4S |
331.35 |
|
5 |
醋氯芬酸 |
Aceclofenac |
89796-99-6 |
C16H13Cl2NO4 |
354.18 |
|
6 |
貝諾酯 |
Benorilate |
5003-48-5 |
C17H15NO5 |
313.3 |
|
7 |
依托考昔 |
Etoricoxib |
202409-33-4 |
C18H15ClN2O2S |
358.84 |
|
8 |
萘普生 |
Naproxen |
22204-53-1 |
C14H14O3 |
230.26 |
|
9 |
芬布芬 |
Fenbufen |
36330-85-5 |
C16H14O3 |
254.28 |
|
10 |
奧沙普秦 |
Oxaprozin |
21256-18-8 |
C18H15NO3 |
293.32 |
|
11 |
尼美舒利 |
Nimesulide |
51803-78-2 |
C13H12N2O5S |
308.31 |
|
12 |
氟比洛芬 |
Flurbiprofen |
5104-49-4 |
C15H13FO2 |
244.26 |
|
13 |
雙氯芬酸鈉 |
Diclofenac sodium |
15307-79-6 |
C14H10Cl2NNaO2 |
318.13 |
|
14 |
依托度酸 |
Etodolac |
41340-25-4 |
C17H21NO3 |
287.35 |
|
15 |
吲哚美辛 |
Indometacin |
53-86-1 |
C19H16ClNO4 |
357.79 |
|
16 |
萘丁美酮 |
Nabumetone |
42924-53-8 |
C15H16O2 |
228.29 |
|
17 |
非普拉宗 |
Feprazone |
30748-29-9 |
C20H20N2O2 |
320.39 |
|
18 |
塞來昔布 |
Celecoxib |
169590-42-5 |
C17H14F3N3O2S |
381.37 |
A
A
附錄B
參考質(zhì)譜條件
a) 離子源：電噴霧離子源（ESI源）；
b) 檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；
c) 掃描方式：正離子模式和負(fù)離子模式；
d) 電噴霧電壓（IS）：5500 V（ES+）；-4500 V（ESI-）；
e) 氣簾氣（CUR）：35 psi；
f) 霧化器（GS1）：55 psi；
g) 輔助氣（GS2）：55 psi；
h) 離子源溫度（TEM）：500 ℃。
表B.1 二氟尼柳等18種化合物定性、定量離子和質(zhì)譜分析參數(shù)
|
序號 |
化合物名稱 |
電離 |
母離子 |
子離子 |
去簇電壓 |
碰撞能量 |
保留時間 |
|
方式 |
(m/z) |
(m/z) |
(V) |
(V) |
（min） |
||
|
1 |
二氟尼柳 |
ESI- |
248.9 |
204.9* |
60 |
27 |
8.19 |
|
156.9 |
45 |
||||||
|
2 |
美洛昔康 |
ESI+ |
352 |
115.0* |
80 |
22 |
8.41 |
|
141 |
26 |
||||||
|
3 |
舒林酸 |
ESI+ |
357.1 |
233.1* |
105 |
66 |
8.58 |
|
340.1 |
30 |
||||||
|
4 |
吡羅昔康 |
ESI+ |
332 |
164.0* |
80 |
25 |
8.61 |
|
121 |
28 |
||||||
|
5 |
醋氯芬酸 |
ESI- |
354 |
74.9* |
20 |
25 |
8.93 |
|
251.9 |
30 |
||||||
|
6 |
貝諾酯 |
ESI+ |
314.1 |
121.1* |
68 |
20 |
8.96 |
|
272.1 |
11 |
||||||
|
7 |
依托考昔 |
ESI+ |
359 |
280.1* |
160 |
42 |
9.12 |
|
252.1 |
61 |
||||||
|
8 |
萘普生 |
ESI- |
229 |
170.0* |
10 |
22 |
9.42 |
|
185 |
8 |
||||||
|
9 |
芬布芬 |
ESI+ |
255.1 |
181.1* |
50 |
34 |
9.62 |
|
237.1 |
15 |
||||||
|
10 |
奧沙普秦 |
ESI+ |
294.1 |
103.1* |
90 |
42 |
9.93 |
|
276.1 |
23 |
||||||
|
11 |
尼美舒利 |
ESI- |
306.9 |
197.9* |
60 |
36 |
10.15 |
|
228.9 |
24 |
||||||
|
12 |
氟比諾芬 |
ESI- |
243 |
198.9* |
10 |
15 |
10.15 |
|
179 |
20 |
||||||
|
13 |
雙氯芬酸鈉 |
ESI- |
295.9 |
251.9* |
45 |
16 |
10.26 |
|
213.9 |
30 |
||||||
|
14 |
依托度酸 |
ESI- |
286 |
242.0* |
70 |
23 |
10.28 |
|
212 |
33 |
||||||
|
15 |
吲哚美辛 |
ESI- |
356 |
296.9* |
20 |
27 |
10.42 |
|
311.9 |
13 |
||||||
|
16 |
萘丁美酮 |
ESI+ |
229.1 |
128.1* |
70 |
55 |
10.71 |
|
171.1 |
22 |
||||||
|
17 |
非普拉宗 |
ESI+ |
321.1 |
265.1* |
80 |
20 |
10.95 |
|
253.1 |
23 |
||||||
|
18 |
塞來昔布 |
ESI+ |
382 |
362.1* |
110 |
41 |
11.04 |
|
282.1 |
50 |
*定量離子對。
注：（1）方法提供的監(jiān)測離子對等測定條件為推薦條件，各實驗室可根據(jù)所配置儀器的具體情況作出適當(dāng)調(diào)整；在樣品基質(zhì)有測定干擾的情況下，可選用其他監(jiān)測離子對。
（2）為提高檢測靈敏度，可根據(jù)保留時間分段監(jiān)測各化合物。
附錄C
二氟尼柳等18種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖
圖C.2 18種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提取離子色譜圖
本方法負(fù)責(zé)起草單位：湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院。
驗證單位：大連市食品檢驗所、四川省食品藥品檢驗檢測院、遼寧省食品檢驗檢測院、湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院、重慶市食品藥品檢驗檢測研究院。
主要起草人：張莉、江豐、黎星、劉迪、余婷婷、唐昌云
