關鍵詞：分光光度法；牛奶；蛋白質；鈣；鐵；鋅；美析儀器www.59503.com.cn; V-1300

 

摘要：牛奶營養(yǎng)成分很高，富含蛋白質和微量元素鈣、鐵、鋅等，是人們生活中的主要要營養(yǎng)食品之一。因此，分析牛奶中的營養(yǎng)成分含量是很有必要的工作。本實驗在普通實驗室條件，采用簡單科學快捷的方法分析某品牌牛奶中部分成分含量。

1、實驗目的

用分光光度法測某牛奶中蛋白質、鈣、鐵、鋅的含量。

2、實驗原理

牛乳中的主要的蛋白質是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質的混合物，等電點為4.7。利用等電點時溶解度最低的原理，將牛乳的pH調至4.7時，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質后便可得到純酪蛋白。

雙縮脲(NH₂CONHCONH₂)在堿性溶液中與硫酸銅反應生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反應，蛋白質分子中含有許多肽鍵在堿性溶液中也能與Cu²⁺反應產生紫紅色化合物。在一定范圍內，其顏色的深淺與蛋白質濃度成正比。因此，可以利用比色法測定蛋白質濃度。雙縮脲法是測定蛋白質濃度的常用方法之一。操作簡便、迅速、受蛋白質種類性質的影響較小，但靈敏度較差，而且特異性不高。除-CONH-有此反應外，-CONH₂、-CH₂NH₂、-CS-NH₂等基團也有此反應。

鈣與身體健康息息相關，鈣除成骨以支撐身體外，還參與人體的代謝活動，它是細胞的主要陽離子，還是人體最活躍的元素之一，缺鈣可導致兒童佝僂病，青少年發(fā)育遲緩，孕婦高血壓，老年人的骨質疏松癥。缺鈣還可引起神經病，糖尿病，外傷流血不止等多種過敏性疾病。補鈣越來越被人們所重視。牛奶中含有易被人體吸收得鈣，有些牛奶產品中還特地加鈣而成為鈣奶。對于液體牛奶中鈣的含量，可采用EDTA法進行直接測定?？紤]到牛奶中含有Fe³⁺、Al³⁺等干擾離子，可以加入少量三乙醇胺以消除它們的，調節(jié)pH≈12～13，以鉻藍黑R作指示劑，指示劑與鈣生成紅色的絡合物，當用EDTA滴定至計量點時，游離出指示劑，溶液呈現(xiàn)藍色。

 

當一束光通過一個吸光物質（通常為溶液）時，溶質吸收了光能，光的強度減弱。吸光度就是用來衡量光被吸收程度的一個物理量。

　　吸光度用A表示。

　　A＝abc，其中a為吸光系數(shù)，單位L/(g·cm),b為液層厚度（通常為比色皿的厚度），單位cm ， c為溶液濃度，單位g/L

　　影響吸光度的因數(shù)是b和c。a是與溶質有關的一個常量。此外，溫度通過影響c，而影響A。

　　符號A，表示物質對光的吸收程度。

鄰二氮菲也叫鄰菲啰啉，是測定微量Fe²⁺的高靈敏度顯色劑在pH 2～9的條件下，F(xiàn)e²⁺與鄰二氮菲生成穩(wěn)定的橙紅色絡合物，在510nm波長處有最大吸收。

該配合物的 lgk_穩(wěn) ＝ 21.3（20 ℃），摩爾吸光系數(shù) ₅₁₀ =1.1×10⁴L?mol^-1?cm^-1 。 在顯色前，首先用鹽酸羥胺把 Fe³⁺ 離子還原為 Fe²⁺，其反應式如下：

2Fe³⁺+2NH₂OH·HCl ＝ 2Fe²⁺+4H⁺ +2Cl^- +N₂↑ +2H₂O

測定時，控制溶液的酸度在 pH＝5 左右較為適宜。酸度高時，反應進行較慢；酸度太低，則 Fe²⁺離子水解，影響顯色。當鐵濃度在5.0 mg／mL以內時，吸光度與Fe²⁺濃度呈直線關系。Bi³⁺、Cd³⁺、Hg⁹⁺、Ag⁺、Zn²⁺等離子在 pH ＝ 2~9 時與鄰二氮菲生成沉淀。 Co²⁺， Ni²⁺， Cu²⁺等離子可與鄰二氮菲形成有色配合物，故應注意它們的干擾。

鋅是人體中必需的微量元素之一，鋅缺乏會阻礙生長發(fā)育，過量又會導致胃癌等疾病。人類從牛奶等飲食中可以獲得一定量的鋅。在pH4.0～5.5的水溶液中，鋅離子與雙硫腙（C₁₃H₁₂N₄S）生成紅色螯合物，摩爾吸光系數(shù) ₅₃₅ =9.3×10⁴L?mol^-1?cm^-1用四氯化碳萃取后比色定量。在選定的pH條件下，用足夠量的硫代硫酸鈉可掩蔽水中存在的少量鉛、銅、鎘、鈷、鉍、鎳、金、鈀、銀、亞錫等干擾金屬離子。

3、實驗步驟

 3.1、試劑的配制、儀器準備

3.11、pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液的配制:

先配A液與B液。A液：0.2mol/L醋酸鈉溶液。B液：0.2mol/L醋酸溶液。

取醋酸鈉固體6.5461g加水溶解并稀釋至100ml，取冰醋酸5mL加水稀釋至100ml，混合即得pH4.7的醋酸——醋酸鈉緩沖液200mL。

3.12、乙醇—乙醚混合液的配制：取25ml95％乙醇與25ml無水乙醚混合

3.13、雙縮脲試劑：稱取CuS0₄·5H₂O 0.3g，酒石酸鉀0.9 g和碘化鉀0.5g，分別溶解后混勻，加6 mol·L^-1NaOH 10mL，最后加水至100mL，貯于棕色瓶中，避光，可長期保存。

3.14、蛋白質標準液(10mg·mL^-1)，用小燒杯稱取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理鹽水溶解后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小燒杯數(shù)次，一并倒入容量瓶中，最后加生理鹽水至刻度線。待測蛋白樣本：將牛奶樣品用生理鹽水準確配制成一定濃度的溶液后再測定；將制得的酪蛋白用生理鹽水準確配制成一定濃度的溶液后再測定。（如若不能溶解，滴加幾滴6mol/L NaOH溶液、分別用l0mL容量瓶定容）

3.15、鐵標準溶液(40.0μg·mL^-1)：:準確稱取0.0345g硫酸鐵銨〔 NH₄ Fe (SO₄)₂·12H₂O〕于燒杯加入6mL6 mol·L^-1 HCl 和少量水，溶解后用純水定容至10mL。此溶液1.00mL含有40.0μg鐵。

3.16、鹽酸羥胺溶液(100 g·L^-1)：:稱取10g鹽酸羥胺(NH₂OH·HCl)，溶于水，并稀釋至100m（新鮮配制，兩周內有效）

3.17、鄰二氮菲溶液(2g·L^-1):：稱取0.20g鄰二氮菲(C₁₂H₈N₂·H₂O)，溶解于加有2滴濃鹽酸的純水，并稀釋至100mL（新鮮配制，兩周內有效）

3.18、醋酸鈉溶液（1.0 mol·L^-1）：:稱取8.2030g醋酸鈉，用純水溶解后稀釋至100mL。

3.19、鋅標準溶液（1.00μg·mL^-1）：準確稱取0.0100g基準鋅于100mL燒杯中，加入6 mol·L^-1HCl 0.5mL，立即蓋上表面皿，待鋅完全溶解后，以少量水沖洗表面皿及燒杯壁，將溶液轉入100mL容量瓶中，定容，即為鋅標準貯備溶液。準確移取1mL鋅標準貯備溶液，稀釋定容至100.0mL，即得1.00μg·mL^-1鋅標準溶液。

3.20、0.1％雙硫酸腙四氯化碳貯備溶液：稱取0.10g雙硫腙（C₁₈H₁₂N₄S），在干燥的燒杯中用四氯化碳溶解后稀釋至100 mL， 倒入棕色瓶中。此溶液置冰箱內保存，可穩(wěn)定數(shù)周。

3.21、雙硫腙四氯化碳溶液：臨用前，吸取適量雙硫腙四氯化碳貯備溶液，用四氯化碳稀釋約30倍，至吸光度為0.4（波長535 nm，1cm比色皿）。

3.22、25％硫代硫酸鈉溶液：稱取64.60g硫代硫酸鈉（Na₂S₂0₃·5H₂0)，溶于100mL純水中。

3.23、1＋1 氨水溶液:10ml氨水加10ml水稀釋

3.24、V-1300型可見分光光度計

3.2、牛奶中酪蛋白的提取

3.21、酪蛋白的粗提

    50mL鮮牛奶加熱至40℃。在攪拌下慢慢加入預熱至40℃、pH4.7的醋酸緩沖液50mL.用精密pH試紙或酸度計調pH至4.7。

將上述懸浮液冷卻至室溫。離心15分鐘（3000 r ·min^-1）。棄去清液，得酪蛋白粗制品。

3.22、酪蛋白的純化

用水洗滌沉淀3次，離心10分鐘（3000r·min^-1），棄去上清液。在沉淀中加入30mL乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。將沉淀攤開在表面皿上，風干；得酪蛋白純品。

3.3、酪蛋白含量的測定

3.31、標準曲線的繪制與樣品的測定

取試管8支，按下表操作。

各管混勻、放置37℃水浴中保溫20min。540nm比色，以空白管調零點，讀取各管吸光度值。

3.32、計算

在電腦上以吸光度值為縱坐標，以蛋白質濃度為橫坐標繪制標準曲線。從標準曲線中查出待測樣本的蛋白質濃度(g／L)，并求出牛奶中蛋白質濃度。由此濃度計算出100mL鮮牛奶中酪蛋白的真實含量。

3.4鈣含量的測定

3.41、鈣制劑鈣含量的測定

準確移取25ml的鮮牛奶和鈣奶，分別轉移到100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

準確移取上述試液20.00mL，加入三乙醇胺溶液5mL，5mol·L^-1NaOH 4mL，加入水20mL，搖勻，加鉻藍黑R8~10滴，用0.01mol·L^-1EDTA標準溶液滴定，接近終點時再補加2～3滴鉻藍黑，當溶液由紅色變?yōu)樗{色即為終點，根據(jù)消耗EDTA的體積，計算出鮮奶和鈣奶中鈣的含量（g/100 mL），并與包裝上注明的含量作比較。

3.42、注意事項

量取鮮奶和鈣奶的量視鈣含量多少而確定，以消耗0.01 mol·L^-1EDTA體積為20~30 mL。牛奶、由于鈣奶均為乳白色，終點顏色變化不太明顯，接近終點時再補加2～3滴指示劑。

3.5鐵含量的測定

3.51、標準曲線的繪制

取25mL比色管6支，按下表順序配制鐵標準系列并記錄測量的數(shù)據(jù)（注意：加入鹽酸 錢干后需搖勻放置2 min，再進行下一步操作），加完試劑后搖勻，放置37℃水浴中保溫15min，以空白液為參比，在510nm下測定各溶液的吸光度值。

取25mL比色管2支，按照上表及上述方法測定510 nm下的吸光度值。

3.52、計算

     在電腦上以吸光度值為縱坐標，以鐵質量濃度（μg?mL）濃度為橫坐標繪制標準曲線。

利用標準曲線計算鮮奶中鐵的含量（mg/100mL）。

3.53、樣品的測定

將50ml鮮奶一滴一滴加到熱坩堝中避免沸騰蒸發(fā)。除去水份后, 強烈加熱至450~550℃ 1小時。冷卻后, 加1 mL濃硝酸蒸發(fā)近干, 重新在450~550℃灼燒（不能濺出）。用少量稀硝酸溶解白色殘液, 轉入10mL容量瓶中稀釋至刻度, 用稀氫氧化鈉溶液調pH=7~8。

3.6鋅含量的測定

3.61、標準曲線的繪制與樣品的測定

   將70ml鮮奶一滴一滴加到熱坩堝中避免沸騰蒸發(fā)。除去水份后, 強烈加熱至450~550℃ 1小時。冷卻后, 加1 mL濃硝酸蒸發(fā)近干, 重新在450~550℃灼燒（不能濺出）。用少量稀硝酸溶解白色殘液, 轉入10mL容量瓶中稀釋至刻度, 用稀氫氧化鈉溶液調pH=7~8。再用蒸餾水稀釋到25ml.

可準確吸取1ml水樣，用純水稀釋至10.0mL。

另取分液漏斗8個，依次加入鋅標準溶液0、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00和5.00mL，各加純水至10mL。

向水樣與標準系列分液漏斗中各加1滴甲基紅指示劑，用1＋1氨水調節(jié)溶液剛顯黃色，再滴加乙酸溶液至紅色（pH約4.4）。加5mL四氯化碳，振搖萃取甲基紅，棄去有機相。

向各分液漏斗中加入5.0mL緩沖溶液混勻，再加入1.0mL硫代硫酸鈉溶液，混勻，再加入10.0mL雙硫腙四氯化碳溶液，強烈振蕩4min，靜置分層。

用脫脂棉或卷細的濾紙擦去分液漏斗頸內的水，棄去最初放出的2～3mL有機相，收集隨后流出的有機相于干燥的10mL比色管內。于535nm波長下，用1cm比色皿，以四氯化碳為參比，測定樣品和標準系列溶液的吸光度。繪制校準曲線，在曲線上查出樣品管中鋅的含量。

注：①本法測鋅要特別注意防止外界污染，同時還要避免在直射陽光下操作。

②加入硫代硫酸鈉除了掩蔽干擾金屬離子的作用外，同時也兼有還原劑的作用，保護雙硫腙不被氧化。由于硫代硫酸鈉也能與鋅離子絡合，因此標準系列中硫代硫酸鈉的加入量應與樣品管一祥。

③振蕩時間必須充分，因硫代硫酸鈉是較強的絡合劑，只有使鋅從絡合物 Zn(S₂O₃)^2-中釋放出來，才能被雙硫腙四氯化碳溶液萃取。而鋅的釋放又比較緩慢，因此振蕩時間要保證4min，否則萃取不完全。為了使樣品和標準的萃取率一致，應盡量做到振搖強度、次數(shù)一致。

 

4．數(shù)據(jù)處理

4.1牛奶中酪蛋白的提取、

酪蛋白含量:6.1354g/100ml

得率=

4.2酪蛋白含量的測定

4.21、標準曲線的繪制與樣品的測定

	1	2	3	4	5	6	待測牛奶液	待測酪蛋白
蛋白質標準液(mL)	－	0.20	0.40	0.60	0.80	1.00	－	－
待測蛋白樣品(mL)	－	－	－	－	－	－	1.00	1.00
0.9%NaCl(mL)	1.00	0.8	0.60	0.40	0.20	-	－	－
雙縮脲試劑(mL)	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00
蛋白質濃度（g/L）	0	0.4	0.8	1.2	1.6	2.0	4.957	3.094
吸光度A	0	0.099	0.196	0.300	0.401	0.508	1.254	0.7816

4.22、計算

在電腦上以吸光度值為縱坐標，以蛋白質濃度為橫坐標繪制標準曲線。從標準曲線中查出待測樣本的蛋白質濃度(g／L)，并求出牛奶中蛋白質濃度。由此濃度計算出100mL鮮牛奶中酪蛋白的真實含量。

故擬合所得y=-0.0029+0.25357x,相關系數(shù)r=0.99988

 

4.3鈣含量的測定

4.31、鈣制劑鈣含量的測定

 

100ml鮮奶含鈣量：

鮮奶包裝上含鈣量為100ml鮮奶含0.102g~0.107g鈣與測量結果基本相符

100ml高鈣奶含鈣量：

而高鈣奶包裝注明含鈣量為100ml高鈣奶含0.130g~0.140g鈣遠遠高于測量結果，說明高鈣奶含鈣量名不符實。

4.4鐵含量的測定

4.41、標準曲線的繪制

	1	2	3	4	5	6	測定管1	測定管2
鐵標準溶液(mL)	0.00	0.50	1.00	1.50	2.00	2.50	－	－
待測鐵溶液	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	1.00	1.00
鹽酸羥胺溶液(mL)	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
鄰二氮菲溶液(mL)	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
醋酸鈉溶液(mL)	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
鐵溶液濃度（ ）	0.00	0.80	1.60	2.40	3.20	4.00	0.294	0.203
蒸餾水(mL)	稀釋至25mL
吸光度	0	0.177	0.377	0.581	0.709	0.874	0.077	0.057

故擬合所得y=0.01229+0.22036x,相關系數(shù)r=0.99773

當吸光度y=0.077時，鐵溶液濃度x=0.294

當吸光度y=0.057時，鐵溶液濃度x=0.249

故其平均值為0.249

每100ml鮮奶中鐵含量為0.249 =0.125mg

4.5鋅含量的測定

4.51、標準曲線的繪制與樣品的測定

 

 

 

 

 

故擬合所得線性方程為y=0.12306+0.67912x,相關系數(shù)r=0.99292

且當吸光度y=0.368時，待測樣濃度x=0.361

故每100ml鮮牛奶含鋅量為0.361

5、討論分析

  5.3鈣含量測定

      鮮奶包裝上含鈣量為100ml鮮奶含0.102g~0.107g鈣與測量結果0.107基本相符

而高鈣奶包裝注明含鈣量為100ml高鈣奶含0.130g~0.140g鈣遠遠高于測量結果 ，雖然滴定到終點時顏色變化比較不明顯，消耗的EDTA的量有一定誤差，但即使是這樣求出的含鈣量也不會這么低，所以說高鈣含鈣量沒有如包裝上所說那么多。實驗注意事項考慮到牛奶中含有Fe³⁺、Al³⁺等干擾離子，可以加入少量三乙醇胺以消除它們的，調節(jié)pH≈12～13，以鉻藍黑R作指示劑，指示劑與鈣生成紅色的絡合物，當用EDTA滴定至計量點時，游離出指示劑，溶液呈現(xiàn)藍色。

5.4 鐵含量的測定

   實驗所測鐵含量為0.125mg/100ml遠遠低于包裝上所說0.3mg/100ml,原因可能由于牛奶灼燒不夠充分，導致部分殘液不溶，致使所得樣品偏少，但也有可能是本身牛奶液中含鐵量與包裝上不符實。本實驗應注意的事項牛奶的灼燒，需一滴一滴的加，防止沸騰蒸發(fā)，而且溶液的酸度要控制在7到8之間為宜，酸度太高，反應進行較慢，酸度太低，則二價鐵離子水解，影響顯色。

5.5 鋅含量的測定

   實驗所測鋅含量為0.123mg/ml遠遠低于包裝上所說的0.40mg/100ml，可能由于該方法測鋅對實驗條件要求較高，要避免外界污染，同時要避免光直照，而且在萃取鋅的時候要求振搖強度，次數(shù)一致，而實際過程中是很難做到的。故繪出的標準曲線有一定誤差。