紫外·可見分光光度計之朗伯-比爾定律及影響因素
發(fā)布日期：2019-11-22 點擊次數(shù)：
當單色光通過液層厚度一定的含吸光物質(zhì)的溶液后，一些光子被吸收，光強就從 I0 降到 I 。I和I0的比值用透光率T（transmittance）表示，T=I/I0。
透光率的負對數(shù)可用于表示入射光被吸收的程度，稱為吸光度A(absorbance),即A =-lgT。從此式可以看出，物質(zhì)的透光率越大，吸光度越小，對光的吸收越弱，反之對光的吸收越強。
物質(zhì)對單色光的吸收度A與吸光物質(zhì)的溶液濃度c和液層厚度l的關系可以用朗伯-比爾定律描述。其中，朗伯定律解釋了吸收度A與液層厚度l的關系，比爾定律解釋了吸收度A與吸光物質(zhì)的溶液濃度c的關系。
朗伯-比爾定律（Lambert-Beer）是吸收光譜的基本定律(適用條件:稀溶液，單色光),它的數(shù)學表達式為: A = Ecl, E為吸收系數(shù)。此公式的物理意義是，當一束平行的單色光通過均勻的含有吸光物質(zhì)的溶液后，溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)濃度c及吸收層厚度l成正比。
吸收系數(shù)E是指一定波長下，吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時的吸光度。在單色光、溶劑、溫度等條件一定下，吸光系數(shù)是物質(zhì)的特征常數(shù)，可作為定性分析的依據(jù)和定量分析靈敏度的估量。在一定條件下，物質(zhì)的吸光系數(shù)越大，吸光能力越強。根據(jù)所采用的濃度單位，可以分為摩爾吸收系數(shù)ε和百分吸收系數(shù)。
1）摩爾吸收系數(shù)ε
摩爾吸收系數(shù)ε，單位為L/(mol*cm)，指在一定波長下，吸光物質(zhì)溶液濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時的吸光度。實際工作時單位可省略不寫。
摩爾吸收系數(shù)ε可分為強吸收、弱吸收和中強吸收。大于10000為強吸收，小于100為弱吸收，100~10000為中強吸收，摩爾吸收系數(shù)ε一般不大于100000。
2）百分吸收系數(shù)
百分吸收系數(shù)又稱為吸收系數(shù)，單位為100ml/(g*cm),指在一定波長下，吸光物質(zhì)溶液濃度為1%（g*cm），液層厚度為1cm時的吸光度。百分吸收系數(shù)在藥物測定中應用更廣泛，《中國藥典》均采用百分吸收系數(shù)，實際工作中單位也可省略不寫。
二、偏離比爾定律的因素
按照比爾定律，當入社單色光的波長、強度和溶液的液層厚度一定時，吸光度對溶液濃度所作的曲線應為一條過原點直線，但是在實際工作中，往往會偏離線性而發(fā)生彎曲。
曲線在實驗中是否為直線取決于兩個因素。一是比爾定律的前提條件：稀溶液。在溶液濃度大時（通常大于0.01mol/L），吸光質(zhì)點的距離減小，彼此間的相互作用改變了它們吸收給定波長的輻射能力造成偏離直線。二是能否控制好影響吸光度測量的因素，主要是化學因素和光學因素兩大類。
1） 化學因素（與樣品有關）
①濃度較大時，吸光粒子距離減小，影響其電荷分布，使其吸收給定波長光的能力改變；
②溶液對光折射率有顯著改變
③吸光物質(zhì)有離解、締合、光化作用、互變作用、或與溶劑的相互作用以及溶劑的影響。
由化學因素引起的Beer偏離，有時可通過控制溶液條件（如濃度，酸度，溫度，時間等）設法減免
2）光學因素（與儀器有關）
1）非單色光
比爾定律只適用于單色光。但紫外-可見分光光度計為了保證足夠的光強度，使用的是具有一定譜帶寬度的光源，必須要采用單色器把所需的波長從連續(xù)光譜中分離出來。分離的波長的寬度取決于單色器的狹縫寬度和棱鏡或光柵的分辨率。由于技術的限制，狹縫寬度不可能無限的小，所以實際測定中入射光不可能絕對單色，因此入射光不僅含有所需波長的光，還會有附近波長的光。
入射光不純：
①影響A與c的關系不成線性，即偏離比爾定律。
②嚴重影響物質(zhì)的吸光系數(shù)值和吸收光譜形狀（變形）。
2）雜散光
雜散光指的是一些不在譜帶寬度范圍內(nèi)的與所需波長相隔較遠的光。
①雜散光的來源：
儀器光學系統(tǒng)的缺陷，儀器保養(yǎng)不善，光學元件受塵染或霉蝕。
②影響：
雜散光可使吸收光譜變形，也會使吸光度值改變。但現(xiàn)代儀器雜散光的影響可以忽略不計。
3）散射光和反射光
入射光通過吸收池內(nèi)外界面時，界面可產(chǎn)生反射作用；入射光通過測試液時，會產(chǎn)生散射作用。因此測量A值時，光強度的減弱并不完全是吸光物質(zhì)的吸收，還有：
①溶劑、容器的吸收
②吸光質(zhì)點，溶劑分子的散射
③吸收池內(nèi)、外界面的反射
可通過空白對比進行補償以抵消反射作用和散射作用的影響。
4）非平行光
如果以一定角度傾斜光通過吸收池，非平行光的實際光程會比垂直照射時的平行光光程增大，導致偏離朗伯-比爾定律，使A值偏高。故吸收池不得傾斜放置光路中。
透光率的負對數(shù)可用于表示入射光被吸收的程度，稱為吸光度A(absorbance),即A =-lgT。從此式可以看出，物質(zhì)的透光率越大，吸光度越小，對光的吸收越弱，反之對光的吸收越強。
物質(zhì)對單色光的吸收度A與吸光物質(zhì)的溶液濃度c和液層厚度l的關系可以用朗伯-比爾定律描述。其中，朗伯定律解釋了吸收度A與液層厚度l的關系，比爾定律解釋了吸收度A與吸光物質(zhì)的溶液濃度c的關系。
朗伯-比爾定律（Lambert-Beer）是吸收光譜的基本定律(適用條件:稀溶液，單色光),它的數(shù)學表達式為: A = Ecl, E為吸收系數(shù)。此公式的物理意義是，當一束平行的單色光通過均勻的含有吸光物質(zhì)的溶液后，溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)濃度c及吸收層厚度l成正比。
吸收系數(shù)E是指一定波長下，吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時的吸光度。在單色光、溶劑、溫度等條件一定下，吸光系數(shù)是物質(zhì)的特征常數(shù)，可作為定性分析的依據(jù)和定量分析靈敏度的估量。在一定條件下，物質(zhì)的吸光系數(shù)越大，吸光能力越強。根據(jù)所采用的濃度單位，可以分為摩爾吸收系數(shù)ε和百分吸收系數(shù)。
1）摩爾吸收系數(shù)ε
摩爾吸收系數(shù)ε，單位為L/(mol*cm)，指在一定波長下，吸光物質(zhì)溶液濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時的吸光度。實際工作時單位可省略不寫。
摩爾吸收系數(shù)ε可分為強吸收、弱吸收和中強吸收。大于10000為強吸收，小于100為弱吸收，100~10000為中強吸收，摩爾吸收系數(shù)ε一般不大于100000。
2）百分吸收系數(shù)
百分吸收系數(shù)又稱為吸收系數(shù)，單位為100ml/(g*cm),指在一定波長下，吸光物質(zhì)溶液濃度為1%（g*cm），液層厚度為1cm時的吸光度。百分吸收系數(shù)在藥物測定中應用更廣泛，《中國藥典》均采用百分吸收系數(shù)，實際工作中單位也可省略不寫。
二、偏離比爾定律的因素
按照比爾定律，當入社單色光的波長、強度和溶液的液層厚度一定時，吸光度對溶液濃度所作的曲線應為一條過原點直線，但是在實際工作中，往往會偏離線性而發(fā)生彎曲。
曲線在實驗中是否為直線取決于兩個因素。一是比爾定律的前提條件：稀溶液。在溶液濃度大時（通常大于0.01mol/L），吸光質(zhì)點的距離減小，彼此間的相互作用改變了它們吸收給定波長的輻射能力造成偏離直線。二是能否控制好影響吸光度測量的因素，主要是化學因素和光學因素兩大類。
1） 化學因素（與樣品有關）
①濃度較大時，吸光粒子距離減小，影響其電荷分布，使其吸收給定波長光的能力改變；
②溶液對光折射率有顯著改變
③吸光物質(zhì)有離解、締合、光化作用、互變作用、或與溶劑的相互作用以及溶劑的影響。
由化學因素引起的Beer偏離，有時可通過控制溶液條件（如濃度，酸度，溫度，時間等）設法減免
2）光學因素（與儀器有關）
1）非單色光
比爾定律只適用于單色光。但紫外-可見分光光度計為了保證足夠的光強度，使用的是具有一定譜帶寬度的光源，必須要采用單色器把所需的波長從連續(xù)光譜中分離出來。分離的波長的寬度取決于單色器的狹縫寬度和棱鏡或光柵的分辨率。由于技術的限制，狹縫寬度不可能無限的小，所以實際測定中入射光不可能絕對單色，因此入射光不僅含有所需波長的光，還會有附近波長的光。
入射光不純：
①影響A與c的關系不成線性，即偏離比爾定律。
②嚴重影響物質(zhì)的吸光系數(shù)值和吸收光譜形狀（變形）。
2）雜散光
雜散光指的是一些不在譜帶寬度范圍內(nèi)的與所需波長相隔較遠的光。
①雜散光的來源：
儀器光學系統(tǒng)的缺陷，儀器保養(yǎng)不善，光學元件受塵染或霉蝕。
②影響：
雜散光可使吸收光譜變形，也會使吸光度值改變。但現(xiàn)代儀器雜散光的影響可以忽略不計。
3）散射光和反射光
入射光通過吸收池內(nèi)外界面時，界面可產(chǎn)生反射作用；入射光通過測試液時，會產(chǎn)生散射作用。因此測量A值時，光強度的減弱并不完全是吸光物質(zhì)的吸收，還有：
①溶劑、容器的吸收
②吸光質(zhì)點，溶劑分子的散射
③吸收池內(nèi)、外界面的反射
可通過空白對比進行補償以抵消反射作用和散射作用的影響。
4）非平行光
如果以一定角度傾斜光通過吸收池，非平行光的實際光程會比垂直照射時的平行光光程增大，導致偏離朗伯-比爾定律，使A值偏高。故吸收池不得傾斜放置光路中。
